以下是探針法熒光定量PCR試劑盒常見問題的處理方法：

　　1.無擴增產(chǎn)物

　　可能原因：樣本中無目標DNA、引物設(shè)計不當、Taq酶失活等。

　　解決方案：檢查樣本質(zhì)量，確保樣本中含有足夠的目標核酸；優(yōu)化引物設(shè)計，使其更特異性地結(jié)合目標序列；更換新的Taq酶。

　　2.非特異性擴增

　　可能原因：退火溫度過低、模板DNA污染等。

　　解決方案：適當提高退火溫度，以增強引物與目標序列的特異性結(jié)合；優(yōu)化模板純化步驟，去除雜質(zhì)和其他非特異性DNA片段。

　　3.探針法熒光定量PCR試劑盒熒光信號異常

　　可能原因：探針或引物濃度不當、熒光染料干擾等。

　　解決方案：仔細調(diào)整探針和引物的濃度，使其達到最佳工作范圍；避免使用可能干擾熒光信號的染料或其他物質(zhì)。

　　4.沒有Ct值

　　可能原因：循環(huán)數(shù)不夠、PCR程序設(shè)置錯誤、引物或探針降解、模板量降解或上樣量不足、引物探針不合適等。

　　解決方案：增加循環(huán)次數(shù)，但一般不超過45循環(huán)；檢查并修正PCR程序中檢測熒光信號的步驟；通過PAGE電泳檢測引物和探針是否降解，如有需要則更換；對未知濃度的樣本從系列稀釋樣本的最高濃度做起，避免模板降解，將模板樣本小量分裝儲備，防止反復(fù)凍融；重新設(shè)計更合適的引物和探針，特別是要確保引物跨越內(nèi)含子以擴增基因組DNA，且上下游引物Tm值相差不宜超過4℃。

　　5.Ct值過晚

　　可能原因：擴增效率低、PCR程序不合適、MgCl?濃度不合適、PCR產(chǎn)物太長、模板中存在抑制物等。

　　解決方案：優(yōu)化引物之間或者引物和探針的比例；重新設(shè)計引物或探針；改用三步法進行反應(yīng)，或者優(yōu)化退火/延伸溫度，可適當降低退火溫度，并在推薦的時間條件下延長10s；增加鎂離子濃度；縮短PCR產(chǎn)物長度；使用高純度模板進行PCR檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。

　　6.陰性對照擴增有信號

　　可能原因：引物設(shè)計不夠優(yōu)化、引物濃度不佳、鎂離子濃度過高、模板有基因組污染、交叉污染等。

　　解決方案：優(yōu)化引物設(shè)計，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比；適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒；在RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增；對操作環(huán)境進行處理，更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等，防止交叉污染。

　　7.探針法熒光定量PCR試劑盒標準曲線不佳

　　可能原因：標準品稀釋或者加樣誤差、標準品降解、引物或探針不佳、模板中存在抑制物等。

　　解決方案：仔細進行標準品稀釋和加樣操作，確保標準品呈梯度；避免標準品反復(fù)凍融，將高濃度DNA模板分裝保存于-20℃或-80℃，現(xiàn)配現(xiàn)用；重新設(shè)計更好更穩(wěn)定的引物或探針；控制模板濃度在一定范圍內(nèi)，一般為50—500ng。

　　8.熔解曲線峰不特異

　　可能原因：引物設(shè)計不夠優(yōu)化、引物濃度不佳、模板有基因組污染、離子濃度不合適等。

　　解決方案：優(yōu)化引物設(shè)計，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度比例；在RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增；適當降低鎂離子濃度，或選擇更適合的mix試劑盒。

　　9.擴增曲線異常

　　可能原因：模板的濃度太高或者降解、熒光染料的降解、操作不當導(dǎo)致指紋或字跡污染、液體揮發(fā)、氣泡等。

　　解決方案：調(diào)整模板濃度至合適范圍，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致降解；更換新鮮的熒光染料；在操作熒光定量PCR時戴上新的一次性手套，蓋上蓋子避免任何指紋或者字跡等污染；檢查耗材氣密性，防止液體蒸發(fā)；規(guī)范移液槍加樣操作，避免產(chǎn)生氣泡。